REZULTATI ANALIZE BAZENSKIH VZORCEV MLEKA IZ SLOVENSKIH KMETIJ- Hitra diagnostika mastitisa z metodo qPCR

Mlečna prireja v Sloveniji – izzivi in priložnosti

Prireja kravjega mleka in njegova predelava sta pomemben del slovenskega kmetijstva. Mlečna panoga postaja vse bolj specializirana – črede se povečujejo, mlečnost narašča, zahteve glede kakovosti pa so čedalje strožje. Kar 91 % mleka odkupijo in obdelajo mlekarne, preostanek pa se uporabi  na kmetijah za različne namene. Z intenzivnejšo rejo se povečuje tudi tveganje za bolezni. Med najpogostejšimi ostaja mastitis (vnetje mlečne žleze), ki rejcem povzroča visoke stroške zaradi zmanjšanja mlečnosti, slabše kakovosti mleka, zdravljenja ter izločanja živali iz črede.

Mastitis pri govedu – povzročitelji in diagnostika

Povzročitelje mastitisa delimo na kužne in okoljske. Med pogostejše kužne povzročitelje uvrščamo bakterije Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae in Mycoplasma spp., med okoljske pa Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Serratia spp., Klebsiella spp., Escherichia coli, Trueperella pyogenes, enterokoke, kvasovke ter alge iz rodu Prototheca.  Povzročitelj v vime najpogosteje vstopa skozi seskov kanal, k nastanku okužbe pa prispevajo tudi slaba higiena, stres, prehrana in zmanjšana odpornost.

Za diagnostiko mastitisa so ključni klinični pregled živali, California mastitis test (CMT) ter laboratorijske preiskave. Najpogostejši znaki mastitisa so boleče ali pordelo vime ter spremenjeno mleko (grudice, kri). Pri težjih oblikah je krava lahko tudi apatična in ima vročino, kar zahteva hitro ukrepanje. Za potrditev okužbe se odvzame vzorec mleka iz posamezne četrti ter opravi bakteriološka preiskava z antibiogramom in preiskava na število somatskih celic.

Vse bolj se uveljavlja tudi molekularna metoda PCR v realnem času (qPCR), ki omogoča hitro in natančno zaznavanje povzročiteljev mastitisa, tudi v bazenskem mleku z nizko koncentracijo bakterij. S to metodo je mogoče spremljati zdravstveno stanje cele črede. Za razliko od klasične bakteriološke preiskave metoda qPCR temelji na zaznavanju genetskega materiala, zato pozitiven rezultat qPCR lahko pomeni prisotnost tako živih kot mrtvih povzročiteljev v vzorcu. qPCR analiza vzorca bazenskega mleka je zanesljiva metoda za pregled povzročiteljev mastitisa na nivoju črede. Zelo uporabna je za preverjanje statusa črede in uspešnosti izvedenih ukrepov za sanacijo kužnih povzročiteljev mastitisa, saj slednji v primerjavi z okoljskimi povzročitelji izvirajo iz mleka okuženih krav, zato do kontaminacije vzorca s temi povzročitelji večinoma ne prihaja iz okolja. Z metodo qPCR lahko zaznamo tudi bakterijo vrste Mycoplasma bovis, ki na običajnih gojiščih za bakteriološko analizo ne zraste. Več informacij o tem, kateri od naštetih mikroorganizmov je res tudi povzročitelj kliničnega mastitisa ali razlog za povečano število somatskih celic, dobimo z vzorčenjem mleka posameznih krav in izvedbo bakteriološke preiskave. S tem pridobimo podatke o stanju posamezne vimenske četrti ter zelo pomemben podatek za pravilno izbiro zdravljenja na podlagi rezultatov antibiograma.

Analiza rezultatov qPCR za bazensko mleko iz 89 slovenskih kmetij

V raziskavi, ki smo jo opravili v okviru raziskovalnega programa »Zdravje živali, okolje in varna hrana« (P4-0092) in bilateralnega projekta »Surovo mleko kot potencialni vir večkratno odpornih bakterij in genov za odpornost« (BI-RS/23-25-007), smo za vzorce bazenskega mleka vpeljali laboratorijsko metodo qPCR za ugotavljanje prisotnosti 15 najpogostejših povzročiteljev mastitisa. Analizirali smo 89 vzorcev mleka iz različnih kmetij v Sloveniji, od katerih smo jih 37 % uvrstili med manjše (do 20 krav molznic), 34 % med srednje velike (20–80 krav molznic) in 29 % med velike (nad 80 krav molznic) kmetije. Zastopanost kmetij v raziskavi glede na regijo je prikazana na sliki 1.

Slika 1: Zastopanost kmetij v raziskavi glede na regijo.

Najpogosteje ugotovljeni povzročitelji so bili stafilokoki (97 %), kvasovke (88 %), S. uberis (80 %) in S. dysgalactiae (76 %). Pogoste so bile tudi bakterije E. coli, enterokoki, T. pyogenes in Corynebacterium bovis. Bakterijo S. aureus smo odkrili v 49 % vzorcev, S. agalactiae pa v 9 %. Mikoplazme so bile zelo redke (1 %), bakterije vrste Mycoplasma bovis pa nismo zaznali. Prisotnost povzročiteljev mastitisa v vzorcih bazenskega mleka je prikazana na sliki 2. Zanimiv je podatek, da je večina vzorcev, pozitivnih na S. agalactiae, izvirala iz dolenjske regije, kjer smo v zadnjem času na terenu že obravnavali okužbe, povezane s to bakterijo.

Slika 2: Prisotnost povzročiteljev mastitisa v vzorcih bazenskega mleka iz 89 slovenskih kmetij, ugotovljena z metodo qPCR; delež pozitivnih in negativnih kmetij je prikazan z odstotki. Mycoplasma bovis ni prikazana, ker ni bila potrjena na nobeni od kmetij, vključenih v raziskavo.

Vpliv molzne higiene in načina presuševanja na pojavnost povzročiteljev mastitisa

Ugotovili smo, da so kmetije, kjer redno čistijo in razkužujejo vime pred in po molži, v mleku imele bistveno manj povzročiteljev mastitisa. Največ razlik smo opazili glede prisotnosti bakterij vrst S. uberis, E. coli in enterokokov – bakterij, ki v praksi povzročajo največ težav. Ustrezna higiena je ključna za preprečevanje okužb. Najslabše rezultate so imele kmetije, kjer ne izvajajo niti čiščenja pred molžo niti razkuževanja po molži, medtem ko samo razkuževanje po molži brez predhodnega čiščenja in razkuževanja pred molžo ni bilo dovolj učinkovito. Čiščenje in razkuževanje pred molžo odstranita umazanijo s seskov ter zmanjšata število bakterij, hkrati pa spodbujata spust mleka. Po molži je vime zaradi odprtih seskovih kanalčkov bolj občutljivo, zato je razkuževanje seskov po molži pomembno za zaščito. Kakovostno razkužilo neguje kožo in preprečuje razpoke, ki lahko postanejo vstopna točka za okužbo.

Primerjali smo tudi pet različnih pristopov presuševanja: (i) samo z antibiotiki, (ii) samo s čepki, (iii) presuševanje vseh krav z antibiotiki in čepki, (iv) selektivno presuševanje ter (v)  presuševanje brez uporabe antibiotikov ali čepkov. Rezultati jasno kažejo, da so bili kužni povzročitelji, kot sta S. aureus in S. agalactiae, najmanj prisotni v vzorcih mleka s kmetij, kjer so vse krave presuševali z uporabo tako antibiotikov kot čepkov. Tak pristop zagotavlja dvojno zaščito: antibiotiki pomagajo odpraviti obstoječe okužbe, čepki pa fizično zaprejo seskov kanal in preprečijo vdor novih povzročiteljev v času sušnega obdobja, ko je vime posebej občutljivo. Pri izbiri načina presuševanja (selektivno ali slepo presuševanje) je zelo pomembno, da odločitev sprejmemo na podlagi analize rezultatov posamezne kmetije, saj lahko v primeru napačne izbire načina presuševanja glede na pogoje na kmetiji, pride do velikega števila okužb v dobi presušitve. Glede odločitve o selektivnem presuševanju na posamezni kmetiji se priporoča upoštevanje smernic za selektivno presuševanje krav v Sloveniji, ki so bile v preteklem letu že objavljene, najdete pa jih lahko tudi na blogu naši spletni strani www.animalis.si.

Molzni sistemi in širjenje okužb

Način molže vpliva na prenos kužnih bakterij, kot sta S. aureus in S. agalactiae. Analiza odgovorov iz vprašalnikov, ki smo jih pripravili za preiskovane kmetije, je potrdila, da je molzni robot glede širjenja okužb še posebej problematičen. 

Bakterijo vrste S. aureus, enega glavnih kužnih povzročiteljev mastitisa, smo zaznali na 49 % kmetij, najpogosteje na kmetijah z molznim robotom (52 %) in mlekovodom (53 %) (slika 3A). Oba sistema uporabljata skupno molzno enoto za vse krave, kar omogoča prenos bakterij z ene živali na drugo. Pri robotih dodatno tveganje predstavljata tudi nenadzorovani vrstni red molže in odvisnost uspešnosti razkuževanja po molži od nastavitev sistema, kar ob pomanjkljivi molzni rutini pospešuje širjenje okužb. 

Bakterijo vrste S. agalactiae smo v naši raziskavi pogosteje zaznali na kmetijah z molziščem kot na kmetijah z robotom (slika 3B). Vzrok sta lahko nakup že okuženih živali ali neustrezna molzna rutina pred vzorčenjem. Ker je ta bakterija zelo nalezljiva, je ključno, da preprečimo vnos novih okuženih krav v rejo, v primeru pojava okužbe v čredi pa je nujno takoj uvesti ukrepe za izkoreninjenje S. agalactiae, ki pogosto vodijo do uspešne sanacije.

Slika 3: Prisotnost kužnega povzročitelja Staphylococcus aureus (A) in Streptococcus agalactiae (B) v vzorcu bazenskega mleka glede na način molže.

Zaključek – kaj se lahko naučimo iz te raziskave?

Mastitis ostaja ena največjih zdravstvenih in ekonomskih težav v reji krav molznic. Molekularna metoda qPCR za analizo bazenskega mleka je hitra in zanesljiva za zgodnje odkrivanje kužnih povzročiteljev, zlasti bakterij vrste S. aureus in S. agalactiae, vendar pa ne omogoča izdelave antibiograma. Najučinkovitejši pristop za vpogled v zdravstveno stanje črede glede povzročiteljev mastitisa je še vedno kombinacija molekularne (qPCR) in klasične bakteriološke preiskave. 

Poznavanje povzročiteljev mastitisa v posamezni reji omogoča izbiro ustreznih ukrepov za preprečevanje in zamejitev okužb, vendar rejci bakteriološke preiskave še vedno premalo uporabljajo. V raziskavi je kar 28 % kmetov navedlo, da bakterioloških analiz ne izvajajo, kar lahko predstavlja resno oviro pri učinkovitem obvladovanju mastitisa. Izvedba bakteriološke preiskave je priporočljiva za testiranje kliničnih mastitisov, novih okužb in krav pred presušitvijo, za splošen vpogled stanja v reji in kontrolo sanacije reje po okužbi pa je zelo primerna tudi qPCR analiza bazenskega mleka. 

Avtorji: Majda Golob ¹, Hana Hrovatin², Tadeja Šavli ³ in Darja Kušar ¹

¹ Inštitut za mikrobiologijo in parazitologijo, Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Gerbičeva 60, 1000 Ljubljana
² Animalis, d.o.o., Tržaška cesta 135, 1000 Ljubljana
³ študentka; Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Gerbičeva 60, 1000 Ljubljana